论文纲要：血小板凋亡与活化发盼望制接洽

       血小板膜糖卵白GPIbα 受体膜外部份含VWF的贯串位点。病理情景下，血小板经过GPIbα 与血管内皮下或血浆中血管性假性血友病源子VWF 举行贯串，这种贯串使得血小板以震动办法粘附在伤害血管外表，与此同声，启用血小板细胞旗号转导体制，引导血小板外表另一受体GPIIb/IIIa 的活化，GPIIb/IIIa与血浆中纤维卵白原和VWF 贯串，最后引导血小板彼此会合成团，产生血小板血栓。血小板外表GPIbα与VWF 的贯串是所有血小板血栓产生的开始要害进程。接洽GPIbα 与VWF 的贯串对血小板的调节和控制效率，创造GPIbα 与VWF 的贯串不只开辟血小板活化、产生血栓，并且开辟血小板爆发凋亡，发端接洽提醒这两条旗号通路对立独力生存。然而，血小板凋亡和活化旗号通路怎样被激活，其旗号通路中哪些卵白介入调节和控制旗号通路以及怎样调节和控制之类，还尚未见通讯。        为了探明血小板凋亡和活化的旗号转导体制以及之间的联系，正文提防经过接洽暂时已知在血小板活化旗号通路中的三个要害卵白：卵白激酶A(cyclic-AMP Dependent Protein Kinase A，PKA)，环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)和卵白激酶C(Protein Kinase C，PKC)在血小板凋亡中的效率，运用这三种卵白的卵白控制剂或激活剂，探明血小板凋亡和活化的发盼望制并商量其之间联系。        试验本领是，取安康理想者外周青筋血，辨别血小板。采用PKA，COX，PKC等多种旗号通路卵白控制剂或激活剂，经过与清洗血小板在各别的功夫和浓淡效率下共通孵育，运用流式细胞术和Western blot等试验本领，检验和测定其对血小板目标，如：线粒体膜电位 (Mitochondrial Transmembrane Potential，ΔΨm) 变革；血小板胞内卵白半胱氨酸的天冬氨酸卵白水解酶(Cysteinylaspartatespecificproteinase，Caspase)的活化；B细胞淋巴液瘤/白血病-2 (B Cell Lymphoma/Lewkmia-2，Bcl-2)家属的变革；血小板细胞膜磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)的外翻；血小板样式的变革和血小板P-采用素的变革以及血小板会合水平变革等。舆论的重要试验截止如次： (1)  PKA控制剂H89不妨计量依附的(25μM，50μM，100μM)开辟血小板展示△Ψm去极化，Caspase-3活化，PS外翻和血小板皱缩的局面，然而H89不会开辟血小板展示血小板活化。经过RNA干预(RNA Interference，RNAi)本领，用PKA催化亚基α(PKA Catalytic Subunit-α，PKACα)的小干预核糖核酸(Small Interfering RNA，siRNA)与血小板无菌前提下共孵育48钟点后，控制PKACα的功效后，展示血小板凋亡的目标变革和血小板对开辟剂展示低活化反馈，而比较组RNA干预后的血小板未展示沟通的试验局面。反馈氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)控制剂N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-Cysteine，NAC)不妨鲜明逆转H89惹起的血小板△Ψm去极化、PS外翻和血小板皱缩的局面； (2)  阿司匹林(Aspirin，ASA)和吲哚美辛(Indomethacin)是接洽COX功效的常用试药，均对COX有控制效率。咱们经过将血小板与各别浓淡的ASA(2.5mM，5mM，10mM， 20mM)和吲哚美辛(50μM，100μM，200μM)共孵育后，检验和测定血小板凋亡和活化目标的变革。接洽截止表露，ASA不妨浓淡梯度和功夫梯度开辟血小板展示△Ψm去极化、PS外翻、Caspase-3活化、血小板皱缩等血小板凋亡局面。用不行逆的Caspase广普控制剂Z-VAD-FMK，不只不妨控制血小板内Caspase-3的活化，并且不妨灵验的控制血小板△Ψm的功效变换和血小板样式的变换。吲哚美辛不许开辟血小板展示△Ψm去极化变换和PS外翻的局面； (3)  平常人清洗血小板与0.1µM的PKC激活剂佛波酯(Phorbol-12-Myristate-13-Acetate，PMA)或溶剂二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)在37°C辨别孵育30秒钟、45秒钟、60秒钟、75秒钟和90秒钟后，介入TMRE(100 nM)避光孵育20秒钟。流式细胞仪检验和测定创造，0.1μM的PMA功夫依附性开辟血小板展示△ψm去极化；血小板与PMA(0.1µM和1µM)或DMSO在37°C孵育2钟点后，Western blot检验和测定表露，PMA剂量依附性开辟Caspase-3爆发17 kDa活化片断，提醒PKC激活剂PMA呈浓淡依附性的开辟血小板内caspase-3发生存化裂解；        为了更好的精确PKC与血小板凋亡之间的联系，咱们还检验和测定了PKC控制后血小板内△ψm的变革和PS的表露情景，截止表露PKC广谱性控制剂星形孢菌素(Staurosporine，STS)不妨鲜明的开辟血小板展示△Ψm去极化、PS外翻、血小板线粒体内细胞色素C的开释、Caspase-8和-9的活化以及p38丝裂原激活卵白激酶(p38 Mitogen-Activated Protein Kinase，p38 MAPK)活化的局面，用SB203580控制p38 MAPK的活性不妨灵验的控制STS开辟的血小板凋亡局面；而PKC奇异性控制剂Gö 6983不许开辟血小板展示△ψm去极化和PS外翻的变革。STS和Gö 6983均不许开辟血小板P-采用素在细胞膜上表白； 论断：本接洽表明PKA介入调节和控制安静休息状况下的血小板稳态，控制PKA活性会开辟血小板展示凋亡局面，其重要体制大概是经过冲破活性氧ROS爆发及废除的平稳，使适量的ROS在血小板内积聚，而激励血小板爆发凋亡；ASA开辟的血小板凋亡局面是COX非依附的，COX不介入调节和控制血小板凋亡，大概重要介入调节和控制血小板活化局面；经过比较PKC激活剂和控制剂对血小板效率的感化，表明PKC介入调节和控制活化血小板的凋亡旗号通路。经过对这血小板内这三个要害卵白的接洽创造，PKA和PKC介入调节和控制各别状况下血小板的凋亡进程，且其调节和控制体制各别。本接洽截止不只探明各别的调节和控制卵白在血小板介入的止、凝血进程中起到负调节和控制效率体制；而且对接洽血小板活化的负调节和控制功效及其商量关系病症的发病机理具备要害意旨。