舆论摘要：拟黑多刺蚁毒蕈碱性乙酰胆碱受体基因(mAchR)及抑瘤基因(QM)的克隆与表白接洽

拟黑多刺蚁（Polyrhachis vicina Roger）从属于膜翅目（Hymenoptera），蚁科（Formicidae），多刺蚁属（Polyrhachis），是典范的社会性虫豸。该种虫豸具备特殊的等第分裂、动作搀杂、单干精确等社会性特性，是接洽虫豸发育及动作调节和控制体制上面的很好资料。本舆论以拟黑多刺蚁为接洽资料。接洽实质重要分为两局部：第一局部是经过RT-PCR及RACE本领从拟黑多刺蚁体内克隆赢得与虫豸动作关系的毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarine acetylcholine receptor, mAchR）基因的全长cDNA序列，并对其核苷酸序列和卵白序列举行了底栖生物消息学领会；经过及时定量RT-PCR本领对拟黑多刺蚁体内mAchR基因的mRNA表白程度举行了对立定量接洽；运用原位杂交本领对各别等第脑部mAchR基因的mRNA表白程度举行了定位接洽。第二局部是对与发育关系的抑瘤基因QM全长cDNA序列举行了克隆；并运用及时定量RT-PCR本领对拟黑多刺蚁体内QM基因的mRNA表白程度举行了对立定量接洽；建立拟黑多刺蚁QM基因的原核表白载体，并在大肠杆菌BL21菌体内举行了开辟表白。接洽截止如次：1. 拟黑多刺蚁mAchR基因 cDNA序列全长2699 bp，包括一个长度为1800 bp的盛开观赏框（open reading frame, ORF），源代码599个氨基酸酸残基。5’端非源代码区（5’-UTR）长度为189 bp，3’-UTR为711 bp。源代码的卵白质分子量为67.3 kDa，等电点pI=9.11。同源性领会表白该卵白与意大利蜜蜂mAchR的氨基酸酸序列一致性达76.9%，与脊椎众生mAchR各亚型一致性在45.0%-48.3%之间。底栖生物消息学领会表白，该卵白具备典范的7个跨膜电钻构造域及G卵白偶联受体的标记性序列，并且头等氨基酸酸序列所包括的很多功效基序消息在mAchR卵白序列中莫大顽固。所以，不妨决定此次克隆所赢得序名列拟黑多刺蚁mAchR基因的全长cDNA序列，定名为PvmAchR并上传GenBank，赢得序列号为EU573239。2. 沿用荧光及时定量RT-PCR本领对拟黑多刺蚁各别发育阶段、各别等第完全及脑部的PvmAchR mRNA表白程度举行对立定量领会。截止表白，PvmAchR基因在所检验和测定的各个样品内均有表白，在卵期PvmAchR mRNA的表白量较毛蚴期和蛹期高，而若虫期的表白量最高。在三个等第完全比拟中，兵蚁的表白量最高，雌蚁和雄蚁的表白量分别不明显。在三个等第脑部比拟中，雄蚁脑部的表白量最低，而兵蚁脑部和雌蚁脑部的表白量分别不明显。按照PvmAchR基因在毛蚴期和若虫体内mRNA表白程度的分别性估计，拟黑多刺蚁PvmAchR卵白的重要功效大概是在安排若虫更为搀杂的动作中起要害效率；由各别等第完全及脑部之间的分别表白进一步提醒，PvmAchR大概与各别等第蚂蚁的动作关系。3. 沿用原位杂交本领对拟黑多刺蚁各别等第脑部PvmAchR基因的mRNA表白程度举行定位接洽，截止创造PvmAchR mRNA在各个等第蚂蚁脑部普遍表白。除去蕈形骸萼部和领部阴性反馈比拟弱外，其余部位均有阴性神经元胞体和神经纤维生存，并表露各别的表白形式。按照各个等第脑部蕈形骸、视叶和嗅叶的强阴性反馈，估计PvmAchR大概介入视觉和感觉消息的获得与调整。在三个等第的各别脑区中，兵蚁嗅球内具备对立较高程度的表白；雄蚁视叶内具备对立较高程度的表白。证明PvmAchR基因在各别等第蚂蚁同一脑区的分别性表白与各别等第蚂蚁在社会性集体中所承担的不同业为工作关系。4. 拟黑多刺蚁QM基因cDNA序列全长827 bp，包括一个长度为660 bp的盛开观赏框（open reading frame, ORF），源代码219个氨基酸酸残基。5’-UTR为91 bp，3’-UTR为77 bp。源代码的卵白质分子量为25.1 kDa，表面等电点pI=9.93。该卵白与意大利蜜蜂QM的氨基酸酸序列一致性达98.2%，与脊椎众生QM卵白序列最低一致度达77.2%。NJ法树立领会表露，亲缘联系较近的物种QM卵白之间的进化联系较近。底栖生物消息学领会表白，QM卵白属于分外泌型、非糖基化卵白，含有多个在进化上莫大顽固的功效位点。将拟黑多刺蚁QM基因定名为PvQM，并上传GenBank，赢得序列号为EU360768。5. 运用高效原核表白载体pGEX-5X-1，胜利建立了拟黑多刺蚁QM基因的原核表白载体，并在大肠杆菌BL2第11中学赢得胜利开辟表白。SDS-PAGE卵白电泳表露，带有GST标签的GST/QM融洽卵白分子量为51kDa安排。手段条带分子量与预期分子量普遍，并且阴性比较内没有手段卵白的表白，证明开辟表白胜利。截止领会表露该融洽卵白重要以可溶性情势表白，极小批以包容体情势生存。QM基因的原核表白载体的建立为抗机制备奠定普通。6. 沿用荧光及时定量RT-PCR本领对拟黑多刺蚁各别发育阶段、各别等第完全及脑部其PvQM mRNA的表白程度举行对立定量领会。截止表白，PvQM mRNA在一切检验和测定样品均有表白。卵期的表白量最高；在毛蚴期，一龄毛蚴至三龄毛蚴期表白量渐渐升高，而四龄毛蚴和蛹期的表白量最低；若虫的表白量比毛蚴期高然而低于卵期的表白。证明PvQM卵白大概与拟黑多刺蚁的发育出色关系。在三个等第完全及脑部之间的比拟创造，PvQM mRNA在兵蚁完全及脑部的表白量最高，在雌蚁和雄蚁之间的表白量分别不明显，估计兵蚁体内PvQM mRNA的高程度表白大概与兵蚁在社会性集体中的动作关系。内项接洽初次从社会性虫豸拟黑多刺蚁中克隆赢得mAchR和QM基因的全长cDNA序列，并将序列上传GenBank；及时定量及原位杂交本领领会创造，mAchR mRNA在拟黑多刺蚁各个发育阶段及若虫体内均有表白，若虫体内的高表白及各别等第脑部的分别表白，提醒mAchR基因与各别等第若虫动作关系；及时定量本领领会创造，QM mRNA在拟黑多刺蚁各个发育阶段及若虫体内普遍表白，而卵期的高表白及发育阶段的分别表白提醒，QM基因与拟黑多刺蚁的发育出色关系；胜利建立PvQM基因的原核表白载体为后期抗机制备处事奠定普通。那些接洽截止将为深刻商量虫豸mAchR及QM的简直功效奠定普通。