论文摘要：高效液相色谱在线电生试剂化学发光检测技术的研究
高效液相色谱在线电生试剂化学发光检测技术的研究
张琰图
摘要 高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是一种具有高效、快速及应用广泛的现代分离技术。检测器作为HPLC系统的重要组成部分，充当着 “眼睛”的角色。近年来，在众多的HPLC检测器当中，化学发光检测器(CLD)由于其具有灵敏度高，线形范围宽及仪器设备简单等优点，被越来越多地应用于各种复杂样品中pg或fg级含量化合物的检测，成为一种理想的分离分析方法，也是当今分析科学领域内研究非常活跃的热点之一。
电生试剂化学发光(Chemiluminescence with electrogenerated reagents)法是利用电化学手段，使不稳定氧化剂在电极上在线产生后与被测物质或发光试剂反应产生化学发光，基于直接氧化还原反应、增敏反应或能量转移过程而建立起的一种新型化学发光分析方法，已用于流动注射化学发光分析。但如何提高该法的选择性，使其在实际应用中真正得到更好和更广泛的应用，仍然是存在的一个问题。围绕这一问题，本研究通过在线电生反应生成BrO−, [Cu(HIO6)2]5−, B(OH)3•OOH−, Mn(III), Co(III)和Ag(II) 等具有高反应活性的初生态氧化剂，研究了他们的初生态氧化活性；在完成电解池设计、柱后接口、优化色谱分离和化学发光检测器条件的基础上，提出了一系列灵敏度高、选择性好的HPLC-CL检测新方法，为高效液相色谱增添了一种新的具有高灵敏度的检测器；并将这一新的电生试剂化学发光检测器应用于实际样品如食品中违禁添加剂(苏丹红)、药物残留(糖皮质激素、β2激动剂)及人体血液和尿液某些药物浓度的检测中。现就HPLC-CL检测技术的研究进展（第1章）和具体研究工作（第2-5章）简述如下：
第1章主要就HPLC-CL检测技术的基本原理、系统构建、典型化学发光反应体系（包括鲁米诺及其衍生物、过氧化草酸酯、三（2, 2’-联吡啶）钌(II) 、高锰酸钾、铁氰化钾、四价铈化学发光体系等）及近10年来在生命科学、药学、临床医学、环境及食品等领域的应用和进展情况进行了评述。对这一检测技术在实际应用中存在的问题进行了分析，对其发展方向进行了展望。
第2章就在线电生BrO−- luminol化学发光检测器与高效液相色谱分离技术的结合及其应用进行了研究，包括：
(1) 高效液相色谱在线电生BrO- - luminol化学发光法检测辣椒中的苏丹红
研究发现，苏丹红（I–IV）能够强烈增敏通过恒电流电解方法在线电生BrO-和luminol之间产生的化学发光，提出了一种经高效液相色谱 (HPLC)分离柱后同时检测4种苏丹红（I–IV）的新方法。色谱分离以Nucleosil RP-C18 (250mm×4.6mm i.d., 5 mm, pore size, 100 Å) 为色谱柱，甲醇- 0.2%甲酸水溶液（90:10，v/v）为流动相，柱温 35 °C.，流速1.0 mL min-1，同时分离检测四种苏丹红的总时间为25 min。系统研究并优化了流动相、电生试剂化学发光检测的有关条件。该法检测四种苏丹红的线性范围分别为: 1×10-3～2.0，8×10-3～2.0，5×10-3～2.0, 8×10-3～4.0 µg mL-1；检出限（LOD）(3σ)介于4 ～ 8 µg kg-1，定量限(LOQ) (10σ)为 13 ～ 27 µg kg-1.苏丹红在实际样品中的平均加标回收率为94%～105% （添加水平为1.0，1.5 mg/kg）。对含4种苏丹红浓度分别为0.01 µg mL-1、0.8 µg mL-1的样品溶液连续11次平行测定的相对标准偏差(R.S.D.)都小于3.0 %，其日间精密度R.S.D.都小于4.4 %。该方法已成功应用于辣椒或辣椒酱制品中苏丹红含量的分析。
(2) 高效液相色谱在线电生BrO--luminol化学发光法检测牛奶中残留四环素类化合物的研究
基于四环素类抗生素药物中的四环素(TC)、土霉素(OTC) 、金霉素(CTC)和多西环素(DC) 能够强烈增敏通过恒电流电解方法在线电生BrO-和鲁米诺产生化学发光，提出了一种经高效液相色谱 (HPLC)分离柱后同时检测4种四环素类抗生素药物的新方法。以Nucleosil RP-C18(250 mm×4.6 mm, i.d., 5 mm, pore size, 100 Å) 为色谱柱，0.05 mol L-1磷酸二氢钾(pH 2.5)－乙腈（30:70,v/v）为流动相，流速1.2 mL min-1，柱温25°C，同时分离检测四种抗生素的总时间为11 min。研究并优化了流动相、电生试剂化学发光检测的条件。四种抗生素的检出限为0.002 ～ 0.008 μg mL-1(3 σ)，对0.01 μg mL-1的四种抗生素测定的相对标准偏差为2.0%～3.6%(n = 11)。该检测器已成功应用于牛奶中残留四环素类抗生素含量的分析。
第3章就在线电生[Cu(HIO6)2]5−化学发光检测技术与高效液相色谱结合在兽药残留分析中的应用进行了研究，主要包括以下2个研究工作：
(3) 高效液相色谱在线电生[Cu(HIO6)2]5−- luminol化学发光法检测猪肝组织中残留糖皮质激素类化合物的研究
本文基于曲安西龙(TR)、泼尼松龙(PR)、氢化可的松(HC)、可的松(CO)、甲基强的松龙(MP)、地塞米松(DE)和曲安奈德(TA)等糖皮质激素能够增敏电生的三价铜配合物[Cu(HIO6)2]5−和luminol之间产生的化学发光，提出了一种高效液相色谱 (HPLC)分离柱后化学发光同时检测这些药物的新方法。HPLC分离是以40%的乙腈和60%的醋酸胺水溶液 (1 mmol L-1, pH 6.8)作为流动相进行等度洗脱，在流速为0.8 mL min-1，柱温 20 °C下，7中糖皮质激素在12min内能够很好的分离。猪肝样品中残留糖皮质激素的提取是采用酶法水解并经固相萃取完成的。在优化分离条件和电生试剂化学发光检测条件的基础上，7种糖皮质激素的检出限（LOD）(3σ) 介于0.08 ～ 1.0 ng g-1，定量限(LOQ) (10σ)为 0.27 ～3.33 ng g-1。日内、日间精密度的相对标准偏差(R.S.D.)都低于6.8% 糖皮质激素在实际样品中的平均加标回收率为88%～106%。该法已成功应用于动物组织猪肝中残留糖皮质激素类药物的分析。
(4) 高效液相色谱在线电生[Cu(HIO6)2]5−- luminol化学发光法检测 β2 -激动剂的研究
研究发现，β2 -激动剂类药物特布他林(terbutaline, TB)、沙丁胺醇(salbutamol, SB)和克仑特罗(clenbuterol,CB)等能够增敏电生的三价铜配合物[Cu(HIO6)2]5−和luminol之间产生的化学发光，基于此，提出了一种高效液相色谱 (HPLC)分离化学发光同时检测这些药物的新方法。HPLC分离是以90%的乙腈和10%的醋酸胺水溶液 (20 mmol L-1, pH 4.0)作为流动相进行等度洗脱，在流速为1.0 mL min-1，柱温 25°C下，TB、SB和CB在15min内能够很好的分离。猪肝样品中残留β2 -激动剂的提取是采用酶法水解并经固相萃取完成的。在优化分离条件和电生试剂化学发光检测条件的基础上，TB、SB和CB的检出限（LOD）(3σ)介于0.007 ～ 0.01 ng g-1，定量限(LOQ) (10σ)为 0.023 ～0.033 ng g-1。.日内、日间精密度的相对标准偏差(R.S.D.)都低于4.5%。β2 -激动剂在实际样品中的平均加标回收率为84%～110%。
第4章就在线电生初生态过硼酸盐、化学发光活性进行了系统研究，在此基础上，将这一化学发光检测技术与高效液相色谱联用，建立了左旋多巴(LDP)和盐酸苄丝肼、盐酸甲氧氯普胺等物质的HPLC-CL检测新方法。具体内容包括：
(5) 高效液相色谱电致初生态B(OH)3•OOH- - luminol 化学发光法同时检测左旋多巴和盐酸苄丝肼
在流通体系中，采用恒电流电解硼砂、纯碱和氢氧化钠的水溶液，在Pt电极上在线产生具有初生态特性的B(OH)3•OOH-。基于左旋多巴(LDP)和盐酸苄丝肼(BSH)能抑制B(OH)3•OOH- - luminol 这一化学发光新体系，结合高效液相色谱分离技术，提出了一种同时测定LDP和BSH的化学发光检测新方法，并将其成功应用于复方片剂多巴丝肼及尿样中LDP和BSH的测定。系统研究了在线电生B(OH)3•OOH-的条件及该电生试剂的化学发光反应活性。该法测定LDP和BSH的线性范围分别为0.1～50µg mL-1和0.05～20µg mL-1。检出限(3σ)分别为0.04 µg mL-1和0.01µg mL-1。
(6) 高效液相色谱电致初生态B(OH)3•OOH-- luminol化学发光法检测人血清中的盐酸甲氧氯普胺
基于盐酸甲氧氯普胺(MCP)能抑制初生态B(OH)3•OOH- - luminol 这一化学发光新体系，结合高效液相色谱分离技术，提出了一种测定盐酸甲氧氯普胺的高效液相色谱化学发光检测新方法，并将其成功应用于人血清中MCP的测定。优化了色谱分离及化学发光检测条件。该法测定MCP的线性范围分别为5～500 ng mL-1，检出限(3σ)为0.6 ng mL-1。在一天内通过分别连续11次平行测定浓度为50 ng mL-1 MCP标准溶液，R.S.D.为3.4%。日间精密度是通过测定含MCP浓度都为50 ng mL-1的2个相同溶液进行的，每天进样6次，连续5天，并计算得日间R.S.D为4.2 %。在实际样品中的回收率在94-103%之间。
第5章就在线电生Mn(III)、Ag(II)及Co(III)化学发光检测器与高效液相色谱分离技术的接口，电解池设计及其应用进行了研究，主要包括以下5项工作：
(7) 高效液相色谱电生Mn(III)化学发光法检测吲哚美辛的研究
基于非甾体抗炎药物吲哚美辛(Indomethacin，INM) 可以被电生的Mn(III)直接氧化产生化学发光的原理，设计了一个HPLC在线电生Mn(III)化学发光检测器，并将其应用于药物制剂和一些生物样品中INM的检测。色谱分离是以Nucleosil RP-C18 (250mm×4.6mm i.d., 5 mm, pore size, 100 Å) 为色谱柱，甲醇-水-冰醋酸(67:33:0.1，v/v/v) 为流动相，柱温 20 °C.，流速1.0 mL min-1，分离检测INM的总时间为10 min。系统研究并优化了流动相、电生试剂化学发光检测的有关条件。该法测定INM的线性范围为0.01～10 µg mL-1(R2=0.9991)，检出限(3σ)为8 ng mL-1。日内相对标准偏差(R.S.D.)为2.2% (C=0.1µg mL-1, n=11), 日间相对标准偏差(R.S.D.)为3.0% (C=0.1µg mL-1, n=6，5d)。INM在人尿样中的回收率大于92%。
(8) 高效液相色谱电生Mn(III)化学发光法检测保健食品中的葛根素
基于发现电生Mn(III) 可以直接氧化葛根素(Puerarin，PU)产生强的化学发光，提出了一种测定PU的高效液相色谱化学发光(HPLC-CL)检测新方法，并将该法成功应用于口服液、保健茶、胶囊及片剂等以葛根为原料的保健食品葛根素含量的分析。该法测定PU的线性范围为2×10-3～1.0 µg mL-1 (R2=0.9991)，检出限(3σ)为7×10-4 µg mL-1。对0.01 µg mL-1的PU连续11次平行测定，相对标准偏差为2.3％。PU在一些实际样品中的回收率介于93～108%之间。
(9) 高效液相色谱电生Mn(III)化学发光法检测人体血清和尿样中的卡托普利
设计了一个HPLC在线电生Mn(III)化学发光检测器，即采用在线电化学反应产生氧化剂Mn(III)，通过改变电解电流实现在线控制其浓度和反应活性，来满足色谱柱后化学发光检测的最佳环境和反应条件。在研究和优化流动相及化学发光检测条件的基础上，将该检测器应用于人血清和尿液中卡托普利含量的分析。色谱分离是以Nucleosil RP-C18 (250mm×4.6mm i.d., 5 mm, pore size, 100 Å) 为色谱柱，乙腈-1%醋酸水溶液(60:40,v/v)为流动相，柱温 25 °C.，流速1.2 mL min-1。在选定的实验条件下，卡托普利浓度在5～800 ng mL-1内与化学发光强度成良好的线性关系。对10.0 ng/mL的卡托普利平行测定11次，其标准偏差为2.2%，根据IUPAC规定,计算方法的检出限为0.9 ng mL-1。卡托普利在实际样品中的加标回收率为94.8%～103.2%。
(10) 高效液相色谱在线电生Ag(II)化学发光法检测塞来昔布的研究
基于Ag(II)能够直接氧化塞来昔布(CEL)产生强烈的化学发光，首次提出了一种高效液相色谱(HPLC)在线电生Ag(II)化学发光检测CEL的新方法。在流动体系中，采用恒电流电解技术氧化稳定的Ag(I)，在线产生不稳定的Ag(II)，并将其立即与经HPLC分离后的CEL混合，通过改变电解电流来调节Ag(II)的浓度来满足色谱柱后化学发光反应的需求。系统研究和优化了在线电生Ag(II)的条件、Ag(II)的化学发光特性以及HPLC流动相与该发光体系匹配情况等。在此基础上，将该法应用于药物制剂和人体血清中CEL的测定，结果满意。
(11) 高效液相色谱在线电生Co(III)化学发光法检测盐酸萘甲唑林
基于拟肾上腺素药物盐酸萘甲唑林 (Naphazoline Hydrochloride, NH) 可以被电生的Co(III)直接氧化产生化学发光的原理，设计了一个HPLC在线电生Co(III)化学发光检测器，并将其应用于药物制剂中NH的检测。系统研究了在线电生Co(II)的条件、Co(II)的化学发光特性以及HPLC流动相对这一发光体系的影响等因素。该法测定NH的线性范围为0.1～80.0 µg mL-1 (R2=0.9992)，检出限(3σ)为0.05µg mL-1，对1.0 µg mL-1的NH连续11次平行测定，相对标准偏差为1.8%。
关键词 电生试剂 化学发光检测器 高效液相色谱
