舆论摘要：丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的克隆及其功效初探

丹参Salvia miltiorrhiza Bunge是一种驰名的药用植被，在华夏境内广为培植。动作保守国药之一，丹参的根（也称为“丹参”）在华夏、美利坚合众国、阿曼等地域被普遍运用于心血管、月信不调以及百般炎症等病症的调节。新颖药道学接洽表白，丹参的活性物资分为两大类：一类为脂溶性的丹参酮类复合物，囊括丹参酮I和丹参酮IIA等；另一类为水溶性的酚酸类物资，囊括迷迭香酸、丹酚酸、紫草酸以及丹参素等。基于保守国医以水煎服的用丹方法，以及水溶性因素的明显药理活性，丹参水溶性酚酸类物资已变成暂时接洽的热门。已有试验表白，苯丙烷类新陈代谢道路的中央产品如咖啡茶酸等介入丹参水溶性物资的合成。本舆论以苯丙烷类新陈代谢道路的第一个要害酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）为接洽东西，举行基因克隆，并沿用RNAi的本领对该基因的功效举行接洽，发端商量了苯丙氨酸解氨酶基因与丹参成长发育及次生新陈代谢物合成之间的联系，为证明丹参重要水溶性因素合成的分子机理供给材料，同声也为进一步运用基因工程变革丹参品德、普及丹参灵验因素含量奠定普通。重要接洽本领与截止如次：1.运用DNA Walking的本领从DNA程度克隆赢得了一条丹参苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL1）的全长，Genebank备案号为：EF462460。该基因全长2758 bp，由两个外显子和一个内含子（622 bp）构成，内含子插入的场所与其它物种普遍，且两头具备内含子的顽固序列GT/AG。同源性领会截止表露SmPAL1基因与其它物种中已通讯的PAL基因之间同源性高达80%之上。Southern 杂交截止表露丹参苯丙氨酸解氨酶基因是一个多基因家属，起码含有两个各别的家属分子。2.克隆赢得了约为1.0 kb的SmPAL1基因5’侧翼序列，并对转录开始位点以及TATA box等序列举行了猜测。截止表露该地区含有植被苯丙烷类新陈代谢道路启用子区的顽固元件box1、 box2 ，以及G box、W box、I box、MYB recognition site 、ABA responsive element like sequence等顺式效率元件。在此普通上，运用Real-time PCR本领领会了SmPAL1基因在各别部位以及各别威吓前提下的表白情景。该基因在丹参的根、茎、叶中均有表白，个中以叶中表白量最高。苯丙氨酸解氨酶是开辟酶，多种情况成分均可感化SmPAL1基因的表白，个中ABA、伤害、脱水可开辟该基因的表白，而暗淡则控制SmPAL1基因的表白，低温对该基因的感化不鲜明。 3.建立了SmPAL1基因的原核表白载体，并在Escherichia coli M15菌株中举行了表白。SDS-PAGE领会表露，重组卵白分子量约为77 kDa，与猜测的该基因源代码产品的分子量相符合。酶活性检验和测定表露重组卵白具备较高的苯丙氨酸解氨酶活性，其表现效率的最适温度为60℃，在硼酸缓冲液中的最适pH为8.7。4.采用SmPAL1基因3’端一段长为217bp的片断动作靶片断，建立RNAi载体pSmPAL1。运用农杆菌介导的叶盘变化法变化丹参，经50mg/l卡那霉素挑选以及PCR检验和测定赢得了25株阴性RNAi株系，变化功效为69.4%。进一步领会表露，RNAi植株中SmPAL1基因的表白量均鲜明低沉，而丹参苯丙氨酸解氨酶基因家属的另一分子SmPAL2基因的表白情景则因植株而异。5.对阴性RNAi植株的表型举行了查看，与比较植株比拟，RNAi植株展现出瘦小、生根功夫减速以及叶和茎的外表展示坏死斑等特殊表型，少许植株在培植进程中牺牲。其余，用间苯三酚对RNAi植株的茎切片举行染色，创造RNAi植株中木质素的含量展现出各别水平的低沉。6.运用Folin-Ciocalteu试药对总酚含量举行领会，截止表露，RNAi株系香港中华总商会酚含量贬低约30%～80%。对RNAi株系中的水溶性复合物举行HPLC领会，与比较植株比拟较，RNAi株系中咖啡茶酸的含量鲜明低沉，丹酚酸B的含量则稍微飞腾。