论文摘要：原卟啉IX-声动力学疗法对S180肿瘤细胞的杀伤效应研究

摘要  肿瘤，特别是恶性肿瘤，是当前威胁人类健康的主要疾病之一。鉴于对肿瘤的病因和发病机理尚不清楚，有关肿瘤的治疗方法都不能从根本上解决问题。目前，治疗肿瘤的方法有很多种，包括放疗、化疗以及外科手术疗法等，以超声激活血卟啉治疗恶性肿瘤的声动力疗法（Sonodynamic therapy, SDT）就是其中之一。
声动力疗法是在光动力疗法（Photodynamic therapy，PDT）的基础上建立和发展起来的一种治疗癌症新方法。该疗法是利用超声具有穿透深部组织并能聚焦于肿瘤部位的特性，激活相对无毒性且长时间富集于肿瘤组织的声敏剂，从而产生抗肿瘤因子杀伤肿瘤细胞。相对于PDT而言，SDT治疗肿瘤具有较强的针对性和对正常组织的无创伤性，因而具有良好的应用前景。近些年来，国内外学者就SDT杀伤肿瘤的作用机理开展了多学科的研究工作，并取得一定成果，提出了一系列声空化、自由基、脂质过氧化等理论机制，但其具体机制目前尚无定论。SDT可能受多种因素的影响，不同的声敏剂、超声参数以及所研究的生物系统模型等可能共同决定着其抗肿瘤的机制和疗效。
本论文在综合国内外研究进展的基础上，结合本实验室前期研究成果，依托国家自然科学基金项目“超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子生物学机制”和“超声激活血卟啉诱导肿瘤细胞凋亡的分子生物学机制”的支持，采用频率为2.2 MHz的聚焦超声结合原卟啉IX (Protoporphyrin IX, PPIX) 对S180肿瘤细胞的杀伤作用机制进行研究，目前取得的实验结果如下：
1. 测得实验所用原卟啉IX的最大荧光激发波长为409 nm，最大荧光发射波长为605 nm；通过荧光分光光度法检测PPIX在荷瘤S180小鼠生物体内的运输、摄取、滞留与清除等方面的动态变化过程，计算肿瘤组织和周围正常组织中PPIX的存留比值；绘制肿瘤组织中PPIX浓度与其它各组织的浓度含量比值随时间的变化曲线，选择最佳的超声处理时间点，最大限量地使聚焦超声激活肿瘤组织内的PPIX并且降低对周围健康组织的损伤；实验结果表明静脉注射后24 h为相对安全的超声处理时间点。
2. 通过研究不同强度超声以及不同剂量浓度的原卟啉IX对小鼠S180实体瘤的生长抑制效应影响得出：超声强度为5 W/cm2是其杀伤在体S180肿瘤细胞的一个阈值，在此条件下，超声处理对小鼠S180实体瘤有一定的抑制作用；超声结合PPIX对在体S180肿瘤细胞的生长抑制作用随PPIX剂量的增加而增强， 5 mg/kg的PPIX表现为超声激活原卟啉IX协同作用的浓度阈值。
3. 采用频率为2.2 MHz、强度为5 W/cm2的聚焦超声结合5 mg/kg原卟啉IX对在体S180肉瘤的损伤作用进行研究，实验结果表明：单纯5 mg/kg PPIX对S180肿瘤组织几乎没有生长抑制作用，单纯超声处理表现出轻微的肿瘤生长抑制效应，而超声结合原卟啉IX对肿瘤组织的生长抑制效应随时间延迟表现更为明显，处理后3天其肿瘤的大小基本上维持在对照组小鼠肿瘤大小的一半左右；比较不同处理组荷瘤S180小鼠的存活期得出，单纯超声和单纯PPIX对小鼠的存活期影响不明显，而超声结合PPIX处理组小鼠的平均存活时间显著高于其它三个实验组；同时S180肿瘤组织的透射电镜观察发现，超声激活PPIX所产生的协同作用严重破坏了S180肿瘤细胞的结构特性，其损伤程度明显大于单纯超声处理组。
4. 筛选聚焦超声结合原卟啉IX杀伤离体S180肿瘤细胞的实验参数，发现声照强度、处理时间以及PPIX浓度均存在相对的损伤作用阈值：超声所诱导的细胞损伤存在一个敏感阈值，为3 W/cm2，当超声强度高于这一阈值时，细胞的破坏急剧增强；原卟啉IX对于声动力学疗法诱导的细胞损伤存在相对较小的浓度剂量阈值（120 μM），当PPIX浓度低于这一阈值时，超声激活PPIX的协同杀伤效应不明显，当PPIX浓度大于这一阈值时，二者的联合作用表现显著增强；同时，超声处理时间也存在一定的阈值（30 s），小于这一阈值时，超声激活PPIX的联合作用与单纯超声组无明显差别，大于这一阈值时，超声显著增强了PPIX的细胞毒效应。
5. 强度为3 W/cm2的聚焦超声结合120 µmol/L原卟啉IX作用于S180肿瘤细胞30 s时，其对细胞的杀伤率达50.91%，而同等条件下单纯超声对细胞的杀伤率仅为24.24%，单纯PPIX对肿瘤细胞无明显的细胞毒作用。扫描电镜和透射电镜下观察不同处理组细胞的形态学变化表明原卟啉IX-声动力学处理对S180肿瘤细胞的损伤主要表现在胞质内有大量空泡形成、线粒体膨胀和嵴消失、胞膜破损、胞质大量流失、核膜边界模糊及部分核膜破损出现核质流失、核内有空区、部分染色质凝集等。因此可推测超声激活原卟啉IX对S180肿瘤细胞的损伤作用靶位点主要集中在细胞质膜、核膜以及线粒体等一些膜性细胞器上。
6. 通过自由基捕捉剂和活性氧测定剂盒检测超声结合原卟啉IX作用过程中活性氧的生成，TBA显色法检测声化学处理对S180肿瘤细胞脂质过氧化的影响，铜试剂萃取法检测处理后细胞悬液中游离脂肪酸的含量，酶化学分析方法检测处理后肿瘤细胞内几种主要抗氧化物酶类的活性变化。实验结果显示：声化学处理后细胞悬液中活性氧含量明显升高，与其它三组相比均表现出极显著性差异（p﹤0.01）；超声结合原卟啉IX对S180肿瘤细胞的杀伤作用可以被组氨酸显著抑制；联合处理组细胞的脂质过氧化含量明显高于单纯超声组和单纯PPIX组；超声结合PPIX处理导致细胞膜的破坏引起膜磷脂降解，释放脂肪酸进入细胞悬液；处理后细胞内的MDA含量显著升高，SOD、GSH-PX、CAT活力均表现为不同程度的下降，推测超声激活原卟啉IX产生活性氧自由基攻击细胞膜造成膜脂质过氧化，细胞内的抗氧化物酶活性下降，可能是导致细胞死亡的主要因素之一。
本实验选择原卟啉IX研究声动力学疗法抗肿瘤的生物学特性，通过研究超声结合原卟啉IX对S180肿瘤细胞及其在体肿瘤组织的杀伤作用，初步探讨SDT杀伤肿瘤细胞的生物学机制，为优选更佳的卟啉类声敏剂药物提供理论基础，从而为声动力学早日应用于肿瘤的临床诊断和治疗积累相关资料。
关键词：　聚焦超声  原卟啉IX  声动力学疗法  S180