论文摘要：土贝母、贯叶连翘组织培养及其有效成分分离提取的研究
土贝母是葫芦科土贝母属植物，其有效成分土贝母皂甙具有抗肿瘤和抗病毒活性。贯叶连翘是藤黄科金丝桃属植物，其有效成分金丝桃素具有抗病毒和抗肿瘤活性。分别以土贝母、贯叶连翘为材料，系统研究其组织培养技术和有效成分分离提取技术，建立其相应的植株再生系统和其有效成分分离提取工艺，并探研其形态发生的过程和规律，该研究无论是对丰富植物组织培养的理论，还是对应用生物技术改造土贝母、贯叶连翘品种、生产有效活性成分等均具有重要的意义。本实验的主要结果可归纳如下： 1. 系统研究了土贝母茎段、叶片外植体愈伤组织的诱导培养方法，获得了大量的愈伤组织，并分析了其土贝母皂甙的含量。实验表明茎段愈伤组织形成早于叶片；茎段在MS附加不同激素种类和浓度的培养基中能形成愈伤组织，叶片在MS附加2,4-D、2,4-D与NAA、NAA与BA的组合中能形成愈伤组织，而单独使用BA，ZT，NAA以及2,4-D、NAA与BA的组合中不能形成愈伤组织。愈伤组织在MS培养基上比在B5培养基上生长快，但易于褐化。愈伤组织在MS附加2,4-D2.0 mg/L、NAA0.5 mg/L和BA1.0 mg/L的培养基上积累土贝母皂甙的含量最高; 在B5+2,4-D2.0 mg/L+ NAA0.5 mg/L+ BA1.0 mg/L上多次继代培养后，可形成较为均一、稳定的无性愈伤组织系。 2. 系统研究了土贝母茎段和叶片外植体的培养方法和植株再生技术，获得了大量的试管苗。实验表明叶片接入MS+BA3.0 mg/L+NAA1.0 mg/L的培养基上可直接产生不定芽；由叶片、茎段外植体形成的愈伤组织在MS+BA2.0 mg/L+IAA1.0 mg/L的培养基上也可产生不定芽。MS附加BA2.0 mg/L,IAA0.1 mg/L适于腋芽发育，增殖，将腋芽和不定芽切下转入1/2MS附加IBA1.0 mg/L 的培养基上，经15 d培养后，50%芽基部生根而成苗。诱导愈伤组织、不定芽，选用pH6.0,琼脂0.8-1.0%；诱导生根选用pH5.8，琼脂0.6-0.7%。 3. 系统研究了贯叶连翘茎段和叶片外植体的培养方法和植株再生技术，获得了大量的试管苗。用MS培养基作为基本培养基，附加BA0.2 mg/L+2,4-D3.0-4.0(mg/L)适于愈伤组织的诱导；附加BA3.0-5.0 (mg/L)+NAA0.5-1.0( mg/L)适于芽的诱导；附加BA0.05 mg/L+NAA1.0 mg/L或者IBA1.0mg/L适于芽的增殖；附加IBA1.0 mg/L或者1/2MS适于根的诱导。实验表明在MS附加高浓度比值BA/NAA的培养基中可诱导以上外植体产生的愈伤组织在短期内产生大量的不定芽和试管苗，但同时又诱导产生了许多超度含水态苗。在培养过程中，BA浓度先高后低，既可获得大量的试管苗，又相对降低了超度含水态苗的比率，是贯叶连翘快速繁殖程序中的重要一环。 4. 对土贝母、贯叶连翘的茎段、叶片进行了培养、观察，都得到了两类愈伤组织，第一类是坚实紧密，第二类是疏松易碎。贯叶连翘的两类愈伤组织经进一步培养都可产生不定芽，不定芽的发生率高达80%以上。在土贝母的两类愈伤组织中，只有愈伤组织的硬度增强转为翠绿后才可产生不定芽。 5. 以土贝母、贯叶连翘的试管苗为材料，研究了不同生长素类物质对其试管苗生根的影响。结果表明：IBA、IAA诱导的不定根细而长、生长快，直接来源于茎，根系发达。NAA诱导试管苗基部先形成愈伤组织，然后由愈伤组织上产生不定根。2，4-D促进苗基部产生大量的愈伤组织，对生根有抑制作用。 6. 选用陕西太白县土贝母对其土贝母皂甙提取条件进行优化研究，结果表明,土贝母皂甙提取较佳工艺为：，土贝母干物质以7倍量的75%乙醇冷浸，回收乙醇后，室温下用水饱和正丁醇萃取5次（1倍量），水反洗后，浓缩到1/3体积，静置析出，＜60℃真空干燥。土贝母甙甲纯化较佳工艺为：土贝母总皂甙20%热溶于（60℃）水，溶液:n-BuOH（1：4/3）萃取4次，合并第2、3次萃取液，与第一次和第四次萃取液分别浓缩到1/2体积时，冷藏静置析出。经过纯化甙甲含量平均提高22%，而重结晶法土贝母甙甲含量平均提高10.8%，正丁醇不溶部分的甙甲含量平均降低32%。 7. 炮制方法对土贝母皂甙提取效率影响较大，鲜品提取物的甙甲含量最高，烘干后的提取物总皂甙含量和得率最高，综合考虑得率，含量及溶剂消耗，提取前烘干为较佳炮制法。宝鸡太白县的土贝母药材优于渭南合阳县和 咸阳泾阳县的土贝母药材。超滤处理不能提高提取效率。 8. 对从贯叶连翘中提取金丝桃素的工艺条件进行了优化研究，结果表明：金丝桃素提取较佳工艺为：45℃的水浸泡2 h后,加入0.5% NaOH，用75%甲醇在0.05Mpa下78℃提取5次，每次1.5 h，溶媒量为5倍，浓缩温度、干燥温度为78℃。
