舆论摘要：鉴于EST本领的丹参大范围基因克隆及其外源基因变化本领接洽

　　丹参(Salvia miltiorrhiza Bge．)因为其染色体数量少、次生新陈代谢产品种 类多、具备要害药用价格等特性，其分子底栖生物学接洽倍受喜爱。正文以构造培植 的丹参新苗为资料，建立丹参cDNA文库并举行大范围EST序列领会，发展丹参外 源基因高频变化体制的接洽，为丹参功效基因组接洽奠定普通。重要接洽截止如 下： 　　1．经过对尿素法、CTAB法、苯酚法、热硼酸变革法、异硫氢酸胍法丹参RNA 索取品质的比拟，在异硫氢酸胍法的普通上，介入10～20％的低浓淡乙醇积淀多糖 及次生新陈代谢物，创造了丹参高品质总RNA的索取本领。索取的RNA OD_260/280为 2.03(±0.04)，得率为100 μg/g陈腐资料，为丹参的基因克隆、cDNA文库建立、 Northern blotting领会等接洽奠定普通。 　　2．运用Invitrogen的pBluescript IIˉXR cDNA library construction kit建立丹参 cDNA plasmid文库，经过枯燥菌落统计计划水库蓄水容积为1.2×10ˉ5，阴谋对取材功夫丹 参表白基因的掩盖倍数为1O倍之上，具备杰出的掩盖率，符合举行取材功夫基因 表白谱、EST领会等后续接洽。 　　3．随机抉择12,056个cDNA克隆举行5’端的大范围序列领会，测序胜利率 89.5％。运用mass editing步调(http：∥WWW．mrc-lmb．cam．ac．uk/punseq/manual/pregap4 _unix_toc．html)去载体、接洽以及低品质序列或较短的序列。赢得了灵验EST序列 (Read length≥100bp)9,664个，序列平衡长度为41lbp。 　　4．经过EST Analysis Pipeline SystemˉTM Program对9,664条灵验EST举行序列 拼接和组建，获得1,492个臃肿群(Contigs)和3,545个单正片EST(Singletons)， 合计赢得5,037个独力基因(Unigenes)，个中单正片基因占到73.9％。 　　5．辨别运用NCBI的Blastn、Blastx以及SWISS-PROT的Blastx东西对基因 举行功效解释，辨别有1,055,3,428,1,615条基因获得了解释，实足没有解释的 基因有1594条，占赢得基因总额的31.6％。 　　6．运用“GO”分门别类领会，对所解释的基因从细胞构成、分子功效和底栖生物进程 三个上面举行了分门别类领会。辨别有3,130、4,229、和4,789个基因被归类到细胞组 成、分子功效和底栖生物进程分枝中。 　　7．运用“PATHWAY” 领会对波及新陈代谢进程的2,689个基因举行了新陈代谢道路 领会并对其在KEGG新陈代谢图谱中的场所举行了标示。一切基因共波及607条新陈代谢 关系的酶，可归入11个大的新陈代谢道路，个中归类到糖类新陈代谢、氨基酸酸新陈代谢、辅酶 和辅因子新陈代谢以及外源物资底栖生物降解道路中的酶较多，这大概与所取资料居于异 养状况相关。 　　8．经过“Digital Northern”领会，证明本接洽所创造的文库中与成长发育关系 的基因如成长素开辟卵白基因、茎奇异卵白基因和窘境威吓关系的基因如胚胎毛 育后期充分卵白基因、水通道卵白基因、硫素卵白基因、病程关系卵白基因等得 到了超丰度表白，这类基因的EST数占到总EST数的9.77％，该截止与试验甄拔 特性基础普遍。 　　9．发端挑选感化了丹种参的农民杆菌变化体制的成分，决定了丹种参的农民杆菌变化的基 本步调：滴定管苗茎尖在MS培植基上继代培植10d，切取叶片切块预培植ld，过 夜培植农杆菌菌株至OD_6000.8～1.O，离心搜集菌体用MS液体培植基稀释至 OD_6000.4，感化25 min，共培植3d，芽开辟采用培植2次，历次10d，而后生根 采用2次，历次15d，结果在MS基础培植基上生根和继代培植。个中预培植、 共培植、芽开辟培植培植基为MS附加BAP4.4 μmol·1ˉ-1和NAAO.5 μmol·1ˉ-1，生根 采用及生根和继代培植基为不含荷尔蒙的MS基础培植基。芽开辟采用及生根采用 进程采用压均为卡那霉素60 mg·1ˉ-1，抑菌素为头孢霉素200 mg·1ˉ-1。 　　1O．经过变化共赢得抗性芽71株，经PCR，Southern blotting和GUS活性检 测表白变化率为79.4％。 　　本接洽为丹参功效基因组接洽和遗传操纵接洽奠定了较好的普通。