论文摘要：力学大应变刺激下ACL和MCL韧带损伤的细胞和分子机制

肌肉骨骼系统对其物理力学环境等的反应引起人们极大的兴趣和广泛关注。肌肉骨骼系统可以按照其力学环境进行重塑（remodeling），比如缺乏力学刺激会发生“萎缩”(atrophy)变化,而给其过多载荷即发生“肥厚”(hypertrophy) 变化，但其实际的机理目前仍然不是十分清楚。膝关节前交叉韧带（Anterior Cruciate Ligament，ACL)和内侧付韧带（Medial Collateral Ligament ，MCL）是保持膝关节稳定的主要韧带之一， MCL断裂损伤后能愈合，但ACL不能愈合。已有研究表明韧带的修复与其所受的应力有关。但应力对损伤愈合引起的韧带成纤维细胞的分子和细胞生物学机理尚不清楚。成纤维细胞是韧带组织的主要细胞群，是韧带组织按照其力学环境进行重塑的行使者和调控者。以往的研究大都集中在细胞对正常的生理性力学刺激的反应，但是细胞对损伤性力学刺激的反应可能对其愈合更有意义，因此，本研究主要进行了定量的损伤性力学刺激下的ACL/MCL韧带组织的反应以及对其成纤维细胞的分子和细胞水平上的影响。主要的研究内容如下:1． 进行了ex vivo ACL/MCL组织拉伸损伤研究和不同应变值下in vitro ACL/MCL成纤维细胞细胞活力实验研究，并通过这些研究来确定损伤性力学刺激应变大小。2． 研究了ACL/MCL韧带成纤维细胞在定量的创伤性应变刺激下的合成代谢和分解代谢的基因表达行为，采用实时荧光定量PCR（Real-Time Q PCR）方法，研究了Collagen I，Collagen III, Fibronectin，MMP-13,TIMP-1 -SMA和TGF-β1在损伤性应变刺激后随时间的表达变化。3． 研究了定量的损伤性力学刺激下的in vitro ACL/MCL韧带成纤维细胞的细胞生物学反应：包括细胞形态学变化、in vitro模拟创伤恢复、细胞骨架应力纤维装配、对细胞分裂的影响、、细胞增殖、死亡率和凋亡率情况。并比较了ACL和MCL之间的差异。主要的研究结果如下:　　1. 韧带组织在10％单轴拉伸应变10分钟可以导致韧带组织损伤，胶原纤维出现一些裂隙。在20%单轴拉伸应变10分钟后，胶原纤维的某些部位出现撕裂甚至断裂。in vitro ACL／MCL成纤维细胞受-20%、-12%、-8%、12%和20%等双轴应变作用10分钟下，ACL和MCL细胞活力受到了影响。综合上述结果，本研究采用12％等双轴应变作用于in vitro大鼠ACL/MCL韧带成纤维细胞10分钟以模拟创伤性力学刺激。　　2. 合成代谢基因表达方面，12％等双轴应变10分钟后，MCL成纤维细胞在0.5h受到短暂抑制，表现为Collagen I，Collagen III表达显著下降，但1h后恢复并上调了Collagen I，Collagen III以及Fibronectin的表达直至4-12h不等。ACL合成代谢基因表达在0.5h倾向于下调，但统计学比较不显著，1h后恢复并上调了Collagen I，Collagen III以及Fibronectin的表达直至约2-4h不等。ACL对照组和拉伸组的Collagen III表达都比MCL对应组显著减少，差别约2.6-5.0倍不等。在合成代谢上，MCL成纤维细胞则要比ACL对该损伤性力学刺激更敏感。　　3.分解代谢基因表达上，ACL和MCL韧带成纤维细胞都存在MMP-13的基因表达，ACL对照组和拉伸组的MMP-13比MCL的对应组约多5.7-12.5倍。此外，ACL成纤维细胞的MMP-13表达对12%应变比MCL敏感的多。ACL和MCL韧带成纤维细胞都存在TIMP-1的基因表达，MCL各组（除拉伸24小时组外）表达比ACL都显著增高，ACL与MCL在拉伸后的TIMP-1表达的反应模式完全不同。这反映了拉伸前ACL比MCL的分解代谢已经高数倍，拉伸后，ACL比MCL的分解代谢更高。这可能是ACL创伤后挛缩并最终消失的原因所在。　　４． -SMA和TGF-β1的基因表达方面，ACL和MCL韧带成纤维细胞都存在α-SMA的基因表达，其表达量虽然MCL对照组的表达比ACL对照组显著的低，但是MCL的α-SMA基因表达对力学拉伸要比ACL敏感。ACL对照组以及各拉伸组（除了12h组外）都比MCL对应组的TGF-β1高约1.5-4.5倍。　　５．12％等双轴应变拉伸体外培养的细胞10分钟后，2小时内细胞倾向于往中心收缩。细胞骨架F-actin增强，应力纤维发生重排，在细胞内分布更广泛和平行。创伤恢复变慢，表明其迁移速度变慢。12％等双轴应变可以影响处于M期的细胞分裂的进程。　　本研究表明：ACL在MMP-13和TIMP-1表达上对损伤性力学刺激的反应可能是ACL创伤后挛缩消失的原因之一。通过抑制ACL的MMP-13的活性、减少其MMP-13转录水平上的表达和促进其TIMP-1转录水平上的表达等有可能有助于治愈ACL损伤。ACL的α-SMA和TGF-β1的高表达可能是ACL断裂挛缩后无法像MCL那样向前爬行并最终对接愈合的原因之一。调控ACL在α-SMA和TGF-β1转录水平的表达可能有助于其治愈。MCL的Ⅲ型胶原蛋白的高表达可以帮助解释其较好的治愈率，促进ACL的Collagen III转录水平上的表达可能有助于其治愈。此外，提高ACL合成代谢基因表达水平对拉伸力学刺激的敏感性可能有助于其治愈。