舆论摘要：拟南芥蔗糖盐酸合成酶基因克隆及其功效接洽

蔗糖是高档植被光合效率的重要产品，是碳输送的重要情势，也是“库”新陈代谢的重要基质。它具备旗号功效，不妨开辟或控制某些基因的表白，是细胞新陈代谢的安排因子之一。植被蔗糖盐酸合成酶(Sucrose-phosphate synthase, SPS, EC 2.4.1.14)是生存于细胞质中的一种可溶性酶，很久此后被觉得在蔗糖合成进程中表演要害的调节和控制脚色，是催化蔗糖合成的要害酶，SPS安排碳的调配，感化果子的糖新陈代谢以及老练与单薄，并介入细胞分裂与细胞壁纤维素的合成。本课题以形式植被拟南芥SPS为接洽东西，从拟南芥中克隆获得SPS基因，并建立SPS基因的RNA干预载体，沿用农杆菌介导的真空变化法变化拟南芥并赢得转基因植株，对转基因拟南芥植株举行了关系的分子底栖生物学审定及表型领会，同声，运用底栖生物消息学本领对拟南芥等植被中SPS基因的核苷酸及其推导的氨基酸酸序列特性举行了领会。重要试验本领和截止如次：1. 从拟南芥哥伦比亚野生型(Arabidopsis thaliana Columbia ecotype)植株中克隆出SPS的cDNA序列，将其克隆入T载体，经菌落PCR检验和测定、各别控制性内切酶酶切检查保守行DNA序列测定，测序截止与手段基因At5g20280的一致性为99%，该cDNA序列长3287 bp，盛开读码框包括3132 bp核苷酸，源代码1043个氨基酸酸。2. 在赢得的SPS cDNA序列3’端非顽固地区，采用188 bp动作RNA干预片断，建立SPS基因RNA干预表白载体，该载体经PCR检验和测定与多种控制性内切酶酶切考证，其截止均与预期符合，表白RNA干预载体建立精确。3. 将SPS基因RNA干预载体转入农杆菌GV310第11中学，并经过农杆菌介导的真空变化法变化拟南芥哥伦比亚野生型植株，赢得转基因拟南芥T0代健将；将转基因拟南芥T0代健将在含有卡那霉素的MS挑选培植基长进行无菌培植，赢得转基因抗性植株。4. 索取转基因抗性植株与野生型比较植株的总RNA，运用及时定量PCR本领检验和测定并比拟SPS基因在转基因植株与野生型植株中的表白情景后创造，该基因在转基因植株中表白量鲜明低沉，为野生型的8.7%-26.4%，证明RNA干预载体转入拟南芥植株后，灵验的控制了该基因的表白。5. 比较查看转基因抗性植株与野生型比较植株表型创造：转基因植株萌生功夫较野生型约晚1 d，转基因拟南芥植株与野生型比较植株在分割振奋的构造如根和幼叶中表型展示了鲜明分别，对MS培植基中萌生约14 d的56棵野生型拟南芥新苗和53棵转基因新苗统计根长，截止表白野生型拟南芥新苗平衡根长2.94 cm，转基因拟南芥苗平衡根长1.27 cm，一切野生型拟南芥均有侧根爆发，且侧根数较多，而转基因型拟南芥惟有23%的新苗具备侧根。转基因植株在莫大、根长和叶片巨细等上面鲜明小于野生型拟南芥，其侧根数与叶片数量较少，植株成长状况也较野生型比较植株差，证明RNA干预表白载体转入植株使SPS基因表白下调后鲜明地感化了拟南芥植株的成长。6. 沿用底栖生物消息学本领对已在GenBank上备案的拟南芥等植被的SPS基因的核苷酸序列以及推导的氨基酸酸序列举行领会，对其构成因素、导肽、跨膜拓朴构造、疏水性/亲水性、卵白质二级构造及功效域等举行猜测和估计的截止表白：那些植被SPS的源代码核苷酸序列与氨基酸酸序列的构成因素与生化本质基础普遍，不生存导肽，为坐落细胞质中非跨膜的亲水性不宁静卵白，α-电钻和不准则弯曲是其卵白质二级构造的重要构造元件，β-转角和蔓延链传播于所有卵白质中，个中拟南芥SPS二级构造由38.16%的α-电钻、16.01%的蔓延链、9.49%的β-转角和36.34%的无准则弯曲构成，这几培植物SPS均包括三个功效构造域。